许多学生在分子生物学项目进行集中研究在夏季通过皇冠体育的 暑期本科生研究项目. 以下是我们的学生最近完成的项目.
2019
的影响 β-整合素，e-钙粘蛋白和 β果蝇幼虫血细胞的-catenin敲低
Brenda Wong ’21; Advisor: Cris Cheney
切尼实验室的初步观察表明，rab5的敲除减少了角质层袋中的血细胞数量, 除了过量的循环血细胞. 一种假设可能是rab5基因的敲除30518阻断了细胞粘附分子. 该项目的目的是确定是否敲除细胞粘附分子β-整合素，e-钙粘蛋白和 β-catenin-与rab5敲除有相似的效果. 这是通过计算每个幼虫的血细胞数量并对幼虫的血细胞进行成像来完成的.
Domeless和Eater对造血系统的打击
Jose Carranza Celis ’22; Advisor: Cris Cheney
先前的研究表明，敲低Rab5会增加果蝇循环血细胞的数量. 这个项目的目标是探索Rab5蛋白，以及它是否通过不同的受体起作用，如Jak/Stat途径的无圆顶受体或Nimrod家族的Eater受体. Domeless敲除对血细胞数量几乎没有影响，而Eater敲除导致血细胞数量增加，与rab5敲除相当.
氧化应激对DNA错配修复基因的调控
Fred Zucule ’21; Advisor: Travis Brown
错配修复(MMR)是一种DNA修复途径，负责识别DNA错配，并通过招募去除和修复错配的辅助蛋白来促进其修复. MMR缺陷会导致DNA错配的积累, 如果不修复会导致基因组不稳定. MMR缺陷主要表现为MSH2的突变, MSH6或MLH1基因, 哪些分别编码与不匹配的碱基对结合的因子. 糖尿病是人类观察到的最常见的代谢紊乱之一, 细胞中的氧化应激是主要的后果. 当活性氧(ROS)的浓度超过抗氧化剂的浓度时，就会发生氧化应激. ROS通过形成氧化DNA加合物导致突变，从而导致DNA错配. 而MMR负责修复这些病变, 氧化应激下MMR的调控尚不明确. 我们假设氧化应激通过下调MMR基因表达来降低MMR功能. 在这里，我们展示了MLH1的mRNA稳态水平, MSH2, 氧化应激下HEK293T细胞中MSH6下调. 了解MMR的调节可以阐明糖尿病如何增加癌症发展的风险.
CRP和Cra在调节霍乱弧菌的果糖操纵子中具有相反的活性
Christian Beck ’20 and Sayde Perry ‘22; Advisor: Jane Liu
霍乱弧菌是霍乱的病原体，霍乱是一种腹泻疾病，造成超过2人死亡.每年800万人. 革兰氏阴性细菌V. 霍乱在人的小肠中都能存活, 发病机制发生的地方, 以及水生水库, 细菌可以在哪里传播并污染其他水源. 为了在两种环境中生存，V. 霍乱菌必须通过选择性地产生必要的代谢机制来适应可用的碳源. 在这个项目中, 我们把注意力集中在果糖上, 淡水环境中最丰富的糖之一, and how V. 霍乱在遗传水平上调控果糖代谢. 更具体地说, 我们关注Cra和CRP的作用, 两种已知的大肠杆菌转录调控因子, 调控fruB的表达, 果糖操纵子fruBKA的第一个基因. 使用测定法评估转录和翻译水平上表达的变化, 我们发现Cra是fruB的抑制因子，而CRP是fruB的激活因子. 我们还发现CRP是Cra的抑制因子, 表明CRP和Cra相互作用影响下游fruB的表达. 使用转录融合和移动性转移测定, 我们将继续梳理Cra和CRP在调节果糖代谢中的作用, V的内在过程. 霍乱在两种截然不同的环境中茁壮成长的能力.
MtlR和CRP蛋白对霍乱弧菌甘露醇转运蛋白的调控
Micayla George ’20; Advisor: Jane Liu
霍乱是一种由霍乱弧菌引起的胃肠道疾病，每年影响数百万人. V. 由于复杂的细胞信号通路调节各种碳源的摄入，包括甘露醇(一种由植物和藻类产生的丰富碳源)，霍乱在动态环境中具有弹性. 甘露醇摄入量. 霍乱依赖甘露醇磷酸转移酶系统(PTS)。. 甘露醇转运蛋白由位于一组基因(mtlA)中的mtlA基因编码, D, and R) on the mannitol locus; MtlA expression is repressed by protein MtlR and activated by cAMP receptor protein (CRP). 众所周知，CRP结合mtlA启动子来激活转录, 但MtlR的抑制机制尚不清楚. 本项目旨在更好地了解mtl位点的MtlR与CRP蛋白调控因子之间的动态关系，从而深入了解MtlR对MtlA表达的调控作用. 这是通过评估整个V区的MtlR和CRP水平来完成的. 免疫印迹法检测霍乱, 以及通过LacZ检测在没有CRP和/或MtlR的情况下评估mtlA的表达. 先前的研究表明，MtlR水平的波动取决于可用的碳源, 但我们发现c反应蛋白水平相对不受影响. 我们还发现，虽然mtlR基因的缺失增加了mtlA的表达, 当CRP基因也被删除时，没有观察到这种情况, 这表明MtlR抑制是继发于CRP激活mtlA表达.
鉴定CoADR和NPSR功能:CoADR和NPSR减硫能力的宏基因组分析
Max Wragan ’22 and Archie Spindler ‘22; Advisor: Edward J. Crane
辅酶- a二硫还原酶(CoADR)和nadh依赖性过硫还原酶(Npsr)是长期以来被怀疑代谢无机硫化合物的酶，因为它们在厌氧环境中被发现. 以往的研究难以证明CoADR和Npsr通过直接途径进行硫呼吸, 这就是为什么本研究通过宏基因组分析间接探索CoADR和Npsr与硫还原的关系. 这些结果汇集了地球化学, 生物化学, 和微生物学的广泛的蛋白质已知功能，并探讨其与CoADR和Npsr的关系. 我们的数据是通过联合基因组研究所的宏基因组数据库汇编的，并利用他们的BLAST程序运行. 这些数据通过主成分分析(PCA)进行分析，通过CoADR和Npsr与其他已知的硫还原蛋白的相关性和一致性，表明它们是硫还原酶, 它们缺乏硫酸盐还原, 氧化应激, 可逆硫循环蛋白.
利用CRISPR技术鉴定新型化脓性链球菌Cas9功能域
Michelle Garcia ’22; Advisor: Travis Brown
源自化脓性链球菌的rna引导CRISPR-Cas9系统可以被编程切割含有PAM序列(NGG)的dsDNA，从而实现高效和位点特异性的基因组编辑. 尽管S. pyogenes Cas9 (SpCas9)蛋白的结构和生化特征, 其功能区域从未被详细探索过. 利用rna介导的SpCas9序列特异性切割特性, 在这里，我们定制了一个平铺CRISPR库，针对SpCas9编码序列上的每个可能位置来询问其功能重要区域. 使用红色和绿色荧光蛋白报告, 我们利用荧光辅助细胞分选(FASC)技术将活性表达spcas9的细胞与无活性表达spcas9的细胞区分开来。, 随后通过Illumina第二代DNA测序对这两个种群进行测序. 通过使用内部软件对测序数据进行反卷积, 我们的CRISPR Tiling实验被证明能够识别以前已知的SpCas9的基本区域. 最重要的是，我们的研究揭示了氨基酸418-427的一个潜在的新的重要结构域. 我们假设该区域在SpCas9未结合的载脂蛋白状态下保持蛋白质的灵活性，作为与sgRNA结合后螺旋结构域重构的枢轴点. 针对进化上保守的CRISPR- cas9和CRISPR Tiling热残基对这一假设进行了验证，以验证我们的筛选和纯化突变蛋白的功能和结构分析.
分析胰腺发育过程中的RhoA活性
Joana Rodriguez ‘21; Advisor: Travis Brown
胰腺是一个具有双重功能的器官，它产生消化酶和分泌调节血糖稳态的激素，其重要性是毋庸置疑的. 在构成胰腺的各种细胞中，最重要的是内分泌细胞, 哪一个分泌胰岛素，哪一个功能障碍与糖尿病有关. Current stem cell technologies focus on differentiating these cells in vitro; however insufficient knowledge regarding the intracellular signaling pathways that lead to beta cell differentiation during normal pancreas development has been a significant limiting factor in the application and development of these technologies. 有关肠道发育的研究引用了RhoA GTPase信号通路, 与一般细胞运动和细胞骨架重排有关, as essential for endocrine cell differentiation; however, 它在胰腺发育中的作用尚不清楚. Here, 我们利用小鼠模型生物研究胰腺胚胎发生过程中RhoA信号通路的动态调控. 我们采用了“RhoA- fret生物传感器小鼠”来分离RhoA gfp连接到胰腺的荧光, 谁的活动可以根据其在细胞内的定位来确定. 我们的初步研究结果表明，RhoA在三个主要的胰腺细胞区域表现出一种激活模式. 这些结果在不同的时间点将允许我们建立一个模式的RhoA活性在胰腺器官发生.
RAD4参与DNA双链断裂修复
Waylon Henggeler ’20; Advisor: Cristina Negritto
DNA双链断裂(DSBs)发生在电离辐射的存在下，如果修复不当，对细胞可能是极其有害的，甚至是致命的. Homologous recombination (HR) is the most accurate method cells use to repair DSBs; during this process, 姐妹染色单体被用作模板，以确保核苷酸在修复过程中不会丢失. HR是一个复杂的过程，尚未被完全理解，并使用多种蛋白质. RAD50就是这样一种蛋白，在DNA末端切除中起着至关重要的作用, 这是人力资源的最初步骤之一. 本研究旨在阐明RAD4, 一种对不同DNA修复途径的识别步骤至关重要的蛋白质, 核苷酸切除修复, 在酿酒酵母的DSB模型中招募HR蛋白是很重要的. 在rad4 - flag WT、RAD50-FLAG WT和RAD50-FLAG∆rad4三种不同菌株中诱导DSB. 然后使用抗flag珠进行染色质免疫沉淀，结合定量PCR和western blots来研究哪些蛋白质被招募到断裂位点. 我们发现在野生型背景下RAD50明显被招募到断裂位点, 而目前尚不清楚RAD4是否被招募. However, 在WT背景和∆rad4背景下，RAD50的招募有显著差异. 这提示了RAD4的一种新功能:它可能在早期DSB检测和其他蛋白质募集到断裂位点中至关重要.
乙酰胆碱信号通过毒蕈碱而非烟碱受体影响连接细胞迁移的途径
Jorge Gomez ’20; Advisor: Mihoko Kato
乙酰胆碱受体(AChR)是对神经递质乙酰胆碱有反应的膜蛋白，以其在肌肉收缩中的作用而闻名. 加藤等人. 通过转录谱分析发现，在雄性秀丽隐杆线虫中, 连接单元(LC), 引导发育中的性腺向后体迁移的细胞, 表达包括AChR在内的多种神经递质受体. 本研究探讨了这两种类型的乙酰胆碱还原酶的作用, 尼古丁和毒蕈碱, 有没有促进这个细胞的迁移, 连接单元(LC). gar-3的基因敲除突变体, 是LC中唯一表达的毒蕈碱受体, 在LC迁移路径中发现有轻微缺陷. 我们研究了两个烟碱achr是否在LC中表达, Acr-15和acr-16, 也参与了性腺细胞的迁移. 利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物在这些基因中产生功能丧失突变. 通过男性性腺的成像研究了这些敲低突变的影响, 以确定它是否形成了合适的形状. 我们的数据显示，受体组合的敲除不会导致雄性性腺的迁移路径发生显著变化. 由于LC表达了许多烟碱achr, 未来的实验将是用绿色荧光蛋白标记基因组中的其他候选尼古丁受体，以确认LC的表达，并制造更多的AChR突变体组合.
钙信号不是GAR-3乙酰胆碱受体对细胞迁移的下游效应
Eric Blair ’22; Advisor: Mihoko Kato
乙酰胆碱(Acetylcholine, ACh)是一种在许多多细胞生物中表达的神经递质. 我们研究了它在秀丽隐杆线虫器官发生过程中的功能, 透明的微小蠕虫. 在幼虫发育的第3和第4阶段. elegans, 引导性腺迁移的细胞, 连接单元(LC), 在其质膜上表达毒蕈碱类乙酰胆碱受体GAR-3. 当GAR-3被细胞外ACh过度激活时, LC方向相反，可能导致迁移缺陷. 为了发现更多连接乙酰胆碱接收和LC取向的分子途径，我们研究了钙信号, 它通常与其他细胞中的GAR-3乙酰胆碱接收有关. 我们在LC中产生了表达GCaMP的蠕虫菌株, 哪一种是荧光钙指示剂，在钙离子存在时荧光增强. 使用涕灭威, 会增加细胞外乙酰胆碱并过度刺激GAR-3, 我们没有发现GCaMP荧光增加. 这表明Ca+信号没有增加，并且表明Ca+在性腺迁移过程中不是ACh信号通路的下游组分. 进一步的研究方向包括筛选更多的GCaMP蠕虫来证实这一发现，以及探索更多的信号分子如Ca+在LC迁移中的作用.
分析蛋白质PERM-2和PERM-4对C蛋白结构和功能的影响.线虫蛋壳
Tessa Fujisaki ’21; Advisor: Sara Olson
蛋白质对细胞的结构和功能至关重要. 它们组装成各种各样的结构，比如蛋壳. 这个项目的目的是利用线虫C. elegans, 作为一个模型系统来理解蛋白质PERM-2和PERM-4是如何形成蛋壳最外层的, 卵黄层(VL). 本项目研究了VL的装配方式和抗渗性.
首先，洗牌E. 将含有PERM-2和PERM-4蛋白的质粒插入大肠杆菌细胞. 这些质粒用分子标记GST或6Histine残基进行标记. 质粒通过蛋白表达进行验证, 通过亲和柱和SDS-PAGE凝胶纯化. 接下来，测试了它们在不同浓度尿素中的溶解度. Then, 新溶解的蛋白质通过天然的PAGE凝胶运行，以确定它们如何在非变性环境中单独和一起聚合.
结果得出，空向量, GST::PERM-2和GST::PERM-4质粒含有正确的载体. histine::PERM-2没有包含正确的vector. 仅发现GST::PERM-2可溶于6M尿素. 尽管试图倒置电极，制作不同类型的凝胶和各种染色溶液，但PERM-2::GST的原生PAGE凝胶电泳是不成功的. 在未来, 对这两种蛋白质运行一个成功的天然PAGE凝胶将允许更深入地分析它们如何聚合和增加VL的功能.
一种新的工程定位内切酶系统
Fernando Bolio ’22; Advisor: Lenny M. Seligman
归巢内切酶识别和切割特定的长DNA序列, 并被广泛用于基因组编辑. 塞利格曼实验室和其他实验室先前的工作表明，he可以被设计成针对新的DNA序列. 所使用的方法包括改变已知与DNA接触的蛋白质的特定区域，并筛选这些变体与各种DNA目标相互作用的能力. 为了进一步设计he, 我们正在修改由David Liu在哈佛大学的实验室开发的既定系统，称为噬菌体辅助连续进化(PACE)。. 要做到这一点, 我们需要两种不同的质粒:一种M13噬菌体衍生物，用HE代替M13 GeneIII, 以及能够抑制噬菌体复制的质粒，该质粒可被所需HE灭活. 我们利用PCR和Gibson组装技术成功构建了2种不同版本的含M13噬菌体衍生物的HE以及2种不同的抑制质粒. 我们还成功地利用辅助噬菌体创建了M13衍生物的噬菌体复制. 我们目前正在测试质粒的不同组合，看看我们改进的PACE系统是否可以用于设计新的he.
敲除ARX促进胰腺β细胞分化
玛莎·卡斯特罗21
1型糖尿病, 胰岛素分泌少或不分泌胰岛素的慢性疾病, 影响着全世界数百万人. 这种情况是由于胰腺β (β)细胞，导致无法降低血糖水平. 葡萄糖感应、产生胰岛素的干细胞移植 β cells (SC-β)可以为1型糖尿病患者提供持久的治疗. However, 在向β细胞谱系的定向分化过程中, 其他细胞类型，如SC-α, 肠嗜铬细胞的, 外分泌也会产生. 分化方案产生的SC-α只表达ARX转录因子. 我们假设敲除人类干细胞中的ARX会减少SC-α的产生, 从而提高SC-的收率β 从体外SC-β 差异化协议. 为了测试这个, 我们对ARX基因敲除干细胞分化产生的细胞进行了流式细胞术检测. 利用CRISPR-Cas9实现了人干细胞中ARX基因敲除. 我们观察到ARX敲除细胞的分化导致5.35% SC-α和13.SC-β的平均含量为85%.40% SC-α和14.60% SC-β 在野生型细胞中. 我们得出结论，敲除ARX不会显著增加SC-的产生β.
2017
PERM-1在卵母细胞和胚胎中的定位研究. elegans
Anne Berhe ’20; Advisor: Sara Olson; Collaborator: Norani Abilo ’20
线虫C的最内层. 线虫蛋壳, 渗透性屏障, 是动物界最难穿透的材料之一吗. 然而，人们对这层蛋壳的组成和形成知之甚少. C. 秀丽隐杆线虫是许多寄生线虫的模式生物，对这一高度不渗透的蛋壳层的进一步研究可能会导致潜在的药物靶点，这些药物可能会通过蛋壳阻止蠕虫的生存. Ascarosides, 一种含有糖蛔虫糖和脂肪酸样侧链的脂质, 被预测为渗透屏障的重要组成部分. 先前的研究表明，PERM-1对于通透性屏障的形成是必需的，并且该蛋白的epimase和reductase结构域与ascarylose生物合成途径的最后催化步骤相似. 该项目的主要目标是在受精前后定位PERM-1. 我们这个夏天的实验集中在分析线虫卵母细胞和早期胚胎中PERM-1和各种细胞器之间的共定位模式. PERM-1在细胞器之间具有不同水平的共定位，但在任何一个细胞器中并没有一致的高水平共定位.
资助:Paul K. 里希特和伊芙琳E. 库克·里希特纪念基金和R. 尼尔森·史密斯38岁，考文·H. 汉施夏季化学研究基金
半位反应性研究. Horikoshii CoADR
Yongkang Zhang ’18; Advisor: Matthew Sazinsky; Collaborators: Angela Ling ’19, Maxim Leshchinskiy ' 19, Liwam Nerayo ' 20
半位点反应性是一种酶的特性，其中多聚酶的活性位点可以交替地“燃烧”. 在任何给定的时间，只有一半相同的酶亚基是活跃的. 尽管许多具有半位点反应性的重要代谢酶已被鉴定和表征, 半位反应性的原因及其在酶催化效率和机制上的意义尚不清楚. 在本项目中，我们设计、表达和纯化了P的不对称二聚体. 堀越辅酶A二硫还原酶(phCoADR), 吡啶核苷酸二硫氧化还原酶(PNDORs)家族的成员，在体外单质硫还原过程中显示出半位点反应性. 初步的动力学数据表明，不对称二聚体失去了交替发射的能力. 酶的NADH厌氧滴定的初步数据揭示了酶的活性亚基和死亚基之间的还原电位的差异.
资助方:R. 尼尔森·史密斯38岁，考文·H. 汉施夏季化学研究基金
利用CRISPRCas9突变果蝇GDI
Dominique Bruncko ’18; Advisor: Clarissa Cheney
Rab途径对调节囊泡运输非常重要. Rabs是g蛋白，这意味着它们作为GTP或GDP结合的开关. 一种帮助调节这种开关的蛋白质被称为鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDI), 它使拉布保持在GDP束缚状态，并覆盖它的疏水尾巴，使其通过细胞质运输. GDI是基于GDI的第二残基为Asn，由NAT-B翻译后的n端乙酰化产物. 我们的目标是将GDI的第二个残基从Asn突变为Ser，以观察作为NAT-A的底物而不是NAT-B将如何改变GDI与Rabs的相互作用. 我们通过CRISPR-Cas9系统，在果蝇基因组中制造了GDI突变体. 这个系统使用一种蛋白质在一个高度特定的位置切割, 剔除不需要的基因片段. 然后将含有丝氨酸突变和基因组同源区域的质粒注入细胞，通过同源重组引入突变. Currently, CRISPR-Cas9系统及其相关grna已制备完成, 同源质粒正在用Gibson组装法合成. 最初的几次组装尝试都不成功, 因此，为了优化未来的装配，我们做了一些改变. 同源质粒创建后的下一步是将gRNA和同源质粒注入我们的CRISPR-Cas9果蝇菌株中.
资助方:R. 尼尔森·史密斯38岁，考文·H. 汉施夏季化学研究基金
自然密码子重配的原因和影响:eRF1结构和串联终止密码子在纤毛虫
Ira Fleming ’18; Advisor: Andre Cavalcanti
串联停止密码子, 在密码子被破解时用作安全网, 在一些纤毛虫物种和黑腹果蝇中，在带注释的停止密码子后的+2位置或+3和+4位置被发现高度过度代表, 后者以其高终止密码子识读率而闻名. 终止密码子在许多这些纤毛虫物种中的重新分配和推测的终止效率的降低, 更高水平的串联止损暗示了这一点, 可能与真核释放因子1高度保守密码子识别位点和GGQ肽释放位点内及其邻近的几个已鉴定的点突变有关.
资助:教授Corwin Hansch和Bruce Telzer本科研究基金
由一个共同的蛋白质和调节蛋白组成的蛋白质复合物. 秀丽隐杆线虫的蛋壳形成是独立定位的
Julian Prieto ’20; Advisor: Sara Olson
在线虫中C. elegans, 卵母细胞的受精导致不同蛋壳层的分层发育和胚胎的重组，以保护胚胎免于多精并确保其发育. 卵黄层, 蛋壳的最外层, 是否存在于卵母细胞上，并在精子进入后立即从质膜上分离. 我们对这一层的结构和组成知之甚少, 但已经确定CBD-1(几丁质结合域蛋白)对胚胎发育的这一点至关重要. 通过RNAi和CRISPR实验, PERM-2和PERM-4被鉴定为在卵磷脂层形成中具有共同依赖功能的蛋白质. CBD-1同时支撑PERM复合物和EGG复合物(EGG-1-5), 这是受精和激活卵子所必需的). 通过使用CRISPR空突变体和结构域突变体, 我展示了每一个蛋白质复合物的定位都是相互独立的. 有趣的是，一些perm-2(零)突变体仍然形成一些可存活的蛋壳.
资助:教授Corwin Hansch和Bruce Telzer本科研究基金
Rad50和TFIIH在酿酒酵母双链断裂修复中的作用
Robert Buxton ’18; Advisor: Tina Negritto
转录因子TFIIH一直被认为在DNA双链断裂(DSBs)的修复中发挥重要作用. 在这项研究中, 在多种具有野生型(WT)等位基因和Rad50或Rad3基因突变的酿酒酵母菌株中诱导DSBs, 并在不同时间点对各菌株进行取样. TFIIH转录因子的Rad50蛋白或TFB1组分均用FLAG肽标记. 然后通过染色质免疫沉淀(CHIP)分离与标记蛋白相关的DNA，并通过QPCR定量分析目标蛋白在WT和突变酵母中不同时间点在DSB上的占据程度. TFB1和Rad50都是向下拉的, 引物选择在确定占用程度的大小方面起着很大的作用, 但曲线的形状被保留了下来. Rad3-G595R突变体在两次招募事件中的第一次Rad50下拉显著降低，但并未完全下调, 暗示该基金可能在促进向DSB招募Rad50方面发挥作用. Rad3突变体没有表现出WT菌株所显示的两次占用率增加中的第二个, 显示第二次招募Rad50到DSB可能需要TFIIH，但第一次不需要. 必须设计一种测定方法，以确定占用率的增加是否专门由于感兴趣的蛋白质在实验区域或引物区域的行为.
资助:教授Corwin Hansch和Bruce Telzer本科研究基金
核苷酸切除修复中rad3突变体表型的表征
Zoe Zhou ’18; Advisor: Tina Negritto
紫外线辐射可导致相邻DNA碱基对之间形成共价键. 通常情况下，这种类型的损伤是通过一个叫做核苷酸切除修复(NER)的过程来修复的。. However, 在许多人类疾病中, 包括毛硫营养不良(TTD), 编码NER蛋白的基因突变会阻止DNA修复的发生. 在某些TTD病例中，这赋予了光敏表型. 对于这项研究, 我们想要表征四种不同的NER突变体的表型, rad4, rad3-G595R, rad3-R660C, rad3-A596P在S. cerevisiae. rad3突变体是为了模仿人类TTD患者的已知突变而产生的. During NER, Rad4在识别紫外线诱导的DNA损伤中起作用, Rad3作为一种DNA解旋酶，解开DNA并招募随后的修复蛋白. 来描述突变体的特征, 采用钉钉法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)法. 用于钉钉试验, 细胞暴露在四种不同程度的紫外线辐射下:0, 50, 75, 或100 J/m2，然后在两天内生长. 对于PFGE测定，紫外处理后收集时间点. 随后用绿豆核酸酶或TUNEL染色检测胸腺嘧啶二聚体切除后单链断裂的形成. 这些试验的结果表明，突变菌株的行为不同于野生型，也不同于其他菌株. 这些差异可能解释了导致TTD的DNA修复中潜在的分子缺陷.
资助:杜德纳和凯特化学, 生物学及分子生物学基金, 杜德纳和凯特化学基金
差示扫描荧光法筛选PERM-1配体
Inga Van Buren ’18; Advisor: Matthew Sazinsky
寄生虫感染是一个重大的全球健康问题，每年影响20多亿人. 目前的治疗, however, 在幼虫阶段，由于胚胎受到渗透性屏障的保护，是特定的吗. 先前的研究已经确定PERM-1是一种跨膜蛋白，参与C细胞通透性屏障的合成. 秀丽隐杆线虫，线虫感染的模式生物. 本项目的目的是利用差示扫描荧光法(DSF)更好地表征PERM-1的结合伙伴, 作为未来药物筛选的起点. 截断的重组结构在Shuffle细胞过表达系统中表达，并使用基于洗涤剂的方案纯化. 然后使用DSF初步评估PERM-1折叠的程度, 以及结合NAD+的能力, CDP, and UDP. 初步结果表明，PERM-1的熔化温度为~53℃，在衬底暴露时表现出热位移. However, 观察到的热位移不一致，可能源于纯化后PERM-1固有的不稳定性. 结果是, buffer, dye, 必须进一步优化DSF中使用的蛋白质浓度，以提高蛋白质的稳定性及其行为.
资助单位:HHMI
C的实验检验. 通过活体成像显微镜观察野生型和trp-3突变体的秀丽线虫排卵差异
Katiannah Moise ’18; Advisor: Sara Olson
C. 秀丽隐杆线虫已被用作模式生物，以更好地了解受精和卵子发育. 对卵母细胞减数分裂过程的直观观察，有助于开展卵子发育研究. 卵子的活化是由生化反应引起的. 卵母细胞受精早期的钙信号促进了卵子向胚胎的过渡. 卵子的激活包括蛋壳的形成，蛋壳可以防止多精现象，并允许细胞周期的重新激活. 钙信号传导被建模为一个两步过程. 第一步是卵子和精子融合时的初始峰值, 第二种是钙的慢波在卵子内的传播. Takayama & Onami(2016)观察到，最初的Ca2+峰值是由精子特异性的Ca2+渗透性瞬时受体电位(TRP)-3通道产生的，该通道在融合时被传递到卵子. 没有它，最初的尖峰就消失了，但钙波的传播仍有延迟. 对于参与这一事件的钙通道的不同来源所知不多, 所以我正在研究鸡蛋的内质网在为慢波提供钙方面的作用. 除了, 我正在用活体成像显微镜观察trp-3突变体和野生型胚胎之间的排卵和钙波差异. 这些数据将被数学系的合作者用来开发更好的一维/二维数学模型来描述钙波的传播.
资助单位:J. 斯特勒暑期课程充实基金
通过双重遗传选择和荧光激活细胞分选，工程核糖体开关为基础的全细胞生物传感器
Maryann Zhao ’18; Advisor: Jane Liu
全细胞生物传感器是用于评估小分子生物利用度和生物可及性的工具. 与传统乐器相比, 生物传感器的优势不仅在于易于复制和成本低廉，而且需要最少的专业知识. Riboswitches, 大自然自己的生物传感器, 因为它们的分子识别能力而非常适合这个目的吗. 通常存在于原核生物mRNA的5 ' -非翻译区, 核糖开关是在小分子配体存在下在构象状态之间切换的遗传调控元件. 小分子与mRNA适体结构域的结合诱导表达平台的结构变化，从而导致基因表达的转录和/或翻译调节. 我的项目利用了核糖开关的自然机制来回答这个问题, 是否有可能设计出一种人工核糖体开关，它可以感知选定的小分子，并以一种特有的方式控制基因表达? 用多巴胺作为小分子, 我们的平台使用了大肠杆菌库, 每一种都含有天然核蛋白开关的突变变体, 并采用双重遗传选择和荧光激活细胞分选分离功能性核蛋白开关. 开发一个有效的平台来设计基于核糖体开关的生物传感器将为研究人员提供一个强大的检测工具，可以应用于各种情况.
经费来源:部门经费
研究拉布GDI n端乙酰化在果蝇中的功能作用
Michael Poeschla ’18; Advisor: Clarissa Cheney
Rab gtpase包括一个大的蛋白质家族，调节各种与囊泡运输相关的膜运输过程. GDI是Rab通路的重要组成部分, 负责将细胞膜上灭活的Rabs再循环到细胞质中. 切尼实验室先前的数据表明，果蝇的GDI是n端乙酰化的, 催化这种修饰的乙酰转移酶的突变在幼虫后期(3龄)阶段是致命的. 虽然超过80%的真核蛋白被发现是n端乙酰化的, 人们对这种修饰的功能后果知之甚少. 本研究的目的是构建一个体外系统，通过该系统，我们可以评估rabb GDI n端乙酰化对其结合和从膜中提取Rabs能力的影响.
资助单位:HHMI
用FUCCI研究Rab5敲除的血细胞和果蝇想象翼盘的有丝分裂活性
Priyanka Ramanan ’19; Advisor: Clarissa Cheney
Rabs是一种g蛋白，是细胞中囊泡交通的重要指示物. 先前的研究表明，在果蝇血细胞中敲低Rab5会导致循环血细胞过多. 想象翼盘中Rab5的敲低也会导致翅膀畸形. 这个项目的目标是使用FUCCI系统来探索细胞过度增殖作为可能的解释. 引入FUCCI转基因，在想象的翅盘组织和血细胞中特异性表达，以便可视化细胞周期. 在有丝分裂活性方面，野生型和敲除Rab5的想象翅盘与循环血细胞无显著差异.
资助单位:J. 斯特勒暑期课程充实基金
鉴定霍乱弧菌的MtlS靶点
Sabrina Mendez-Contreras ’18; Advisor: Jane Liu
MtlS是一种反义转录到mtlA 5 '非翻译区的小RNA, 甘露醇的糖转运蛋白的编码是什么. MtlS作为mtlA的翻译抑制因子在cis中起作用. 因为细菌的sRNAs可以靶向多个基因, 我们假设除了mtlA外，MtlS还可能调节其他基因. 我们使用RNA靶标预测程序和基于质谱的蛋白质组学来鉴定额外的MtlS靶标. 结果确定了包括mtlA在内的6个潜在目标. 证实MtlS调节了预测的靶标, 我们用gfp创建了每个目标的翻译融合体，并将这些结构引入到V中. 有无mtlS的霍乱菌株. 这使我们能够监测mtlS表达对荧光水平的影响, 也就是目标绿色荧光蛋白的表达量. western blot分析也证实了这一结果. 作为积极对照, 构建了mtlA-GFP融合，我观察到预期的下调. 我观察到在MtlS存在下VC1899的固定相下调, 与蛋白质组学结果显示的上调相反. 前进, 我将确定MtlS结合VC1899转录本的位置以影响基因的下调. 目前还在测试其他假定的mtl目标. 最终，这项工作将扩展我们对mtl在V中的作用的认识. 霍乱和srna.
经费来源:部门经费
基于rna的生物传感器的进化. 大肠杆菌产生超过三倍激活的核开关
Samuel Lin ’20; Advisor: Jane Liu
Small molecules play important roles in cell metabolism and function; thus, 开发高效的小分子传感器是我们进一步了解细胞功能和许多潜在应用的必要条件. 为了制造一个小分子传感器, 我们创建了一个基于rna的生物传感器，由两个主要部分组成:在5 '非翻译区, 结合感兴趣的配体的适体结构域, 适配体结构域与Shine-Dalgarno (SD)序列之间, 介导mRNA构象变化的表达平台, 哪个配体结合, 引起下游基因表达的改变. 用作生物传感器, gfp位于SD序列的下游, 因此，随着配体的结合，细胞荧光将被“打开”和“关闭”. 同样位于SD序列下游的是tetA基因, 它允许从随机RNA文库中选择核糖开关. 为了进化刘实验室先前发现的茶碱核糖开关, 初始“命中”的适体结构域被诱变, 从而创建了一个107的E. coli, 每个都有一个独特的RNA库成员，可以对其进行遗传选择和荧光激活细胞分选(FACS)。. 对诱变文库的三轮选择产生的核开关在配体结合时表现出超过三倍的激活. 我们的选择和筛选方案的改进可能会导致发现具有更高活化和整体荧光的核糖开关.
经费来源:部门经费
临床试验ndva - 3a疫苗可预防高毒力多重耐药真菌感染
Zhaoqi Huang ’19; Advisor: Jonathan Wright
C. 耳球菌是一种新兴的机会性真菌，最近在世界各地的医院环境中出现了巨大的威胁. 念珠菌的少数传染性物种中，C. Auris已经引起了人们的注意，因为它对所有三种主要抗真菌药物的耐药性越来越强. 免疫功能低下患者, 这种真菌可以进入血液并引起侵袭性念珠菌病, 影响中枢神经系统的, organs, 可能会导致死亡. 目前感染C. 估计为30-60%. 基于白念珠菌Als3蛋白的NDV-3A疫苗显示出对C. 临床前和临床试验中的白色念珠菌感染(I/IIb期). 通过生物信息学，我们发现C. auris含有一种与Als3蛋白氨基酸同源的细胞表面蛋白. 运用各种分子生物学和免疫检测工具, 我们鉴定并分离了多种C. 奥瑞丝菌株. 这一发现对念珠菌疫苗的开发具有重要意义，因为先前测试的ndv3疫苗可能显示出对高毒力和耐药念珠菌菌株的保护作用.
经费来源:部门经费